這是一種無性繁殖方法，分離技術較為簡單，采用子實體的菌肉組織進行分離培養，也是獲得純菌種最常用的方法。可選用PSA或PDA等斜面培養基，而且所用的培養基必須保持斜面上無多余的游離冷凝水。分離的“種茹”要求：選擇生長良好、朵形圓整、無雜菌污染和蟲害的子實體。若菌蓋表面有雜物，需用75%的酒精進行消毒。在無菌條件下，用手把茹掰成兩半，再用火焰滅菌過的接種針鉤取干凈的小塊菌肉，迅速拉入滅過菌的斜面培養基上，抽出接種針，塞上棉塞。一般要求分離多次多支試管，以便進行選擇。因金針茹是蓋小而肉薄的食用菌，也可采用特殊的髓部分離法進行組織分離，即左手抓住菌柄，右手持長柄鑷子沿著茹柄方向去掉菌蓋，這時菌柄的頂端露出弧形的生長點，用接種針鉤取生長點的組織塊移入斜面培養基中。之后，把已經分離好的試管放在適溫(20~25℃)的條件下培養，大約經過36h左右，在組織塊周圍長出白色放射狀的菌絲，10d左右即長滿試管。挑選沒有污染雜菌的試管，把金針茹的菌絲體接入新的試管培養基上純化培養即為野生金針茹純菌種。
