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    蛋白酶K的應用技術

       日期:2016-04-20     來源:聚農網    作者:jn720.com    瀏覽:333    
      蛋白酶k是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶,用于生物樣品中蛋白質的一般降解。從林伯氏白色念球菌(tritirachium album limber)中純化得到。該酶有兩個ca2+結合位點,它們離酶的活性中心有一定距離,與催化機理并無直接關系。然而,如果從該酶中除去ca2+,由于出現遠程的結構變化,催化活性將喪失80%左右,但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質。所以,蛋白酶k消化過程中通常加入edta(以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用)。但是,如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白,如角蛋白一類,則可能需要使用含有1mmol/l ca2+而不含edta的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA(ph8.0)至終濃度為2mmol/l,以鰲合ca2+。

      蛋白酶K,是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩定,還具有降解天然蛋白質的能力,因而它應用很廣泛,包括制備脈沖電泳的染色體DNA,蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(pH 4-12.5)均有活性。

      推薦反應緩沖液:50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。

      值得注意的是,蛋白酶K在原位雜交技術中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用,以增加探針與靶核酸結合的機會,提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,都會對細胞的結構有一定的破壞,導致組織切片的脫落,細胞核的消失,從而影響雜交結果.EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現的問題,并能達到理想的染色效果.

      保存:保存在-20℃冰箱里,避免反復凍融,有效保證12月

      孵育溫度為55至65℃,理想孵育溫度為58℃,孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時

     
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