經過滅菌的塑料袋必須冷卻至25℃左右時方可接種。一般是塑料袋滅菌后的第二天即可接種,夏天不超過3d,冬天不超過5d接種為好。否則不僅培養基易失水,而且污染率高。接種的關鍵是嚴格無菌操作,正確掌握熟練的接種技術,動作力求準確迅速。接種前要先做好兩項準備工作:一是選擇質量合格的菌種,菌齡以不超過2個月的為宜。若菌種瓶中長有小原基的菌種,只要時間短,原基未發生腐爛或變色的,仍可使用。接種時把原基棄除即可。而已長出子實體且菌蓋又開傘的菌種,因已彈射出擔孢子,菌種純度降低不能使用。二是接種前要進行消毒,除去物品表面上的病原菌。常用的消毒劑有下面幾種:
(1)甲醛(福爾馬林HCHO):無色氣體,極易揮發且穿透力極強,有強烈的刺激味,會刺激人的皮膚、黏膜,其40%的水溶液稱之為福爾馬林。甲醛在冬季常會析出乳白色的聚合物。甲醛易與蛋白質(包括酶)結合而使蛋白質變性,引起菌種和芽孢死亡。甲醛或福爾馬林是一種強殺菌劑,常用于接種箱、接種室、培養室、栽培房的熏蒸消毒。揮發甲醛的方法有直接加熱法和氧化還原反應法兩種。直接加熱法是將福爾馬林置于容器中,直接在酒精燈上加熱蒸發;氧化還原法是甲醛與高錳酸鉀反應產生大量熱,使甲醛蒸發。
(2)高錳酸鉀(KMn04):暗紫色棱狀晶體,強氧化劑。溶于水,呈紫紅色液體,具有強烈的腐蝕性。高錳酸鉀將酶的-SH基氧化為S-S基,使酶失活,導致菌體死亡,是一種高效的消毒劑。0.1%濃度的高錳酸鉀水溶液作用10~30min即可殺死微生物的營養體。2%~3%溶液短時間作用可導致菌體和芽孢的死亡。其水溶液暴露在空氣中易分解,應隨配隨用。
(3)漂白粉[主要成分為次氯酸鈣Ca(Ocl)2]:白色顆粒粉末,有氯臭,極易潮解,易溶于水、不穩定,遇二氧化碳、光、熱分解。本品含氯量為25%,呈堿性。次氯酸鈣加水可分解生成次氯酸(HOCl),有較強的殺菌作用。殺菌原因是由于它在分解時釋放出氧氣和初生氧(O)。O和Cl2的聯合作用,侵入細胞與菌體蛋白內使酶發生氧化,促使細胞和病毒死亡。新鮮的有效氯極易揮發失效,需密封,以防潮解。通常使用濃度為2%~5%的水溶液,隨配隨用,不能久放。直接噴灑地面,用量為20~40g/m2。
(4)酒精(乙醇CH3CH20H):無色透明液體,易揮發,有強烈的酒氣味,易燃,沸點為78.5℃,可與水任意混溶。使用乙醇消毒,濃度為70%,作用5min即可殺死細胞營養體,對真菌孢子則需要30~60min。乙醇能使蛋白質脫水變性,干擾微生物新陳代謝,抑制其繁殖。95%乙醇殺菌能力反而減弱,因為它接觸菌體后,立即引起菌體表面蛋白質的凝固,形成保護膜,不易滲透入細胞內,故殺菌能力減弱;而70%酒精能滲入菌體細胞,解脫蛋白質表面的水膜,引起新陳代謝障礙,使其失去活性,故有較強的殺菌力。用95%的酒精700ml加水250ml即配成70%的酒精950ml。70%的酒精常用于手的消毒及橡膠手套等制品的消毒。
(5)石炭酸(苯酚C6H50H):低溫下的苯酚為無色或白色針狀、塊狀或三菱形晶體,有特殊氣味和腐蝕味。在空氣中易氧化變紅色,熔點為42~43℃。65℃以上能與水任意混合。石炭酸可殺死微生物的營養體,高濃度下可裂解并穿透細胞壁,使菌體蛋白凝聚沉淀;低濃度下可使細胞的主要酶系統失去活性,一般用5%苯酚水溶液作為消毒劑,配制時,先用熱水溶化,再加入所需的量。
(6)來蘇兒(煤酚皂溶液C6H4OHCH3):黃棕色至紅棕色黏稠液體,有酚臭,甲酚含量為48%~52%。來蘇兒的殺菌力為石炭酸的4倍,殺菌機理與石炭酸相同。1%~2%來蘇兒溶液可用于皮膚浸泡(2min),2%~3%可用于噴灑消毒。常與新潔爾滅、石炭酸等交叉使用于接種箱、無菌室、培養室消毒。
(7)新潔爾滅(十二烷基二甲基苯甲基溴化銨C2lH38NBr):淡黃色膠體狀,是陽離子型的表面活化殺菌劑,多作用于菌體的表面,通過陰陽電荷結合,破壞菌體外膜結構,從而改變細胞壁透性,使菌體腫脹死亡。對無芽孢病原菌、霉菌等具有較強的殺菌作用,效果為
石炭酸的幾十倍,消毒特點是快速、徹底、高效。新潔爾滅濃度為5%,使用時可稀釋20倍,即0.25%濃度,一般用于接種箱、玻璃器皿表面消毒,不適于橡膠手套的消毒,對皮膚及黏膜有輕度刺激,配制后可存放1個月,當溶液呈現顯著黃色或產生較多沉淀時,即應廢棄。
(8)硫磺:淡黃色結晶或粉末,易燃,發出藍色光,產生二氧硫(SO2),對雜菌有較強的殺菌能力,若增加空氣濕度,二氧化硫和水結合為亞硫酸,能顯著增強殺菌效果。常用于熏蒸接種室、培養室。每立方米空間用15g左右為宜。對于周圍環境衛生狀況較差的培養室或栽培室,使用硫磺熏蒸既經濟,效果又好。
(1)甲醛(福爾馬林HCHO):無色氣體,極易揮發且穿透力極強,有強烈的刺激味,會刺激人的皮膚、黏膜,其40%的水溶液稱之為福爾馬林。甲醛在冬季常會析出乳白色的聚合物。甲醛易與蛋白質(包括酶)結合而使蛋白質變性,引起菌種和芽孢死亡。甲醛或福爾馬林是一種強殺菌劑,常用于接種箱、接種室、培養室、栽培房的熏蒸消毒。揮發甲醛的方法有直接加熱法和氧化還原反應法兩種。直接加熱法是將福爾馬林置于容器中,直接在酒精燈上加熱蒸發;氧化還原法是甲醛與高錳酸鉀反應產生大量熱,使甲醛蒸發。
(2)高錳酸鉀(KMn04):暗紫色棱狀晶體,強氧化劑。溶于水,呈紫紅色液體,具有強烈的腐蝕性。高錳酸鉀將酶的-SH基氧化為S-S基,使酶失活,導致菌體死亡,是一種高效的消毒劑。0.1%濃度的高錳酸鉀水溶液作用10~30min即可殺死微生物的營養體。2%~3%溶液短時間作用可導致菌體和芽孢的死亡。其水溶液暴露在空氣中易分解,應隨配隨用。
(3)漂白粉[主要成分為次氯酸鈣Ca(Ocl)2]:白色顆粒粉末,有氯臭,極易潮解,易溶于水、不穩定,遇二氧化碳、光、熱分解。本品含氯量為25%,呈堿性。次氯酸鈣加水可分解生成次氯酸(HOCl),有較強的殺菌作用。殺菌原因是由于它在分解時釋放出氧氣和初生氧(O)。O和Cl2的聯合作用,侵入細胞與菌體蛋白內使酶發生氧化,促使細胞和病毒死亡。新鮮的有效氯極易揮發失效,需密封,以防潮解。通常使用濃度為2%~5%的水溶液,隨配隨用,不能久放。直接噴灑地面,用量為20~40g/m2。
(4)酒精(乙醇CH3CH20H):無色透明液體,易揮發,有強烈的酒氣味,易燃,沸點為78.5℃,可與水任意混溶。使用乙醇消毒,濃度為70%,作用5min即可殺死細胞營養體,對真菌孢子則需要30~60min。乙醇能使蛋白質脫水變性,干擾微生物新陳代謝,抑制其繁殖。95%乙醇殺菌能力反而減弱,因為它接觸菌體后,立即引起菌體表面蛋白質的凝固,形成保護膜,不易滲透入細胞內,故殺菌能力減弱;而70%酒精能滲入菌體細胞,解脫蛋白質表面的水膜,引起新陳代謝障礙,使其失去活性,故有較強的殺菌力。用95%的酒精700ml加水250ml即配成70%的酒精950ml。70%的酒精常用于手的消毒及橡膠手套等制品的消毒。
(5)石炭酸(苯酚C6H50H):低溫下的苯酚為無色或白色針狀、塊狀或三菱形晶體,有特殊氣味和腐蝕味。在空氣中易氧化變紅色,熔點為42~43℃。65℃以上能與水任意混合。石炭酸可殺死微生物的營養體,高濃度下可裂解并穿透細胞壁,使菌體蛋白凝聚沉淀;低濃度下可使細胞的主要酶系統失去活性,一般用5%苯酚水溶液作為消毒劑,配制時,先用熱水溶化,再加入所需的量。
(6)來蘇兒(煤酚皂溶液C6H4OHCH3):黃棕色至紅棕色黏稠液體,有酚臭,甲酚含量為48%~52%。來蘇兒的殺菌力為石炭酸的4倍,殺菌機理與石炭酸相同。1%~2%來蘇兒溶液可用于皮膚浸泡(2min),2%~3%可用于噴灑消毒。常與新潔爾滅、石炭酸等交叉使用于接種箱、無菌室、培養室消毒。
(7)新潔爾滅(十二烷基二甲基苯甲基溴化銨C2lH38NBr):淡黃色膠體狀,是陽離子型的表面活化殺菌劑,多作用于菌體的表面,通過陰陽電荷結合,破壞菌體外膜結構,從而改變細胞壁透性,使菌體腫脹死亡。對無芽孢病原菌、霉菌等具有較強的殺菌作用,效果為
石炭酸的幾十倍,消毒特點是快速、徹底、高效。新潔爾滅濃度為5%,使用時可稀釋20倍,即0.25%濃度,一般用于接種箱、玻璃器皿表面消毒,不適于橡膠手套的消毒,對皮膚及黏膜有輕度刺激,配制后可存放1個月,當溶液呈現顯著黃色或產生較多沉淀時,即應廢棄。
(8)硫磺:淡黃色結晶或粉末,易燃,發出藍色光,產生二氧硫(SO2),對雜菌有較強的殺菌能力,若增加空氣濕度,二氧化硫和水結合為亞硫酸,能顯著增強殺菌效果。常用于熏蒸接種室、培養室。每立方米空間用15g左右為宜。對于周圍環境衛生狀況較差的培養室或栽培室,使用硫磺熏蒸既經濟,效果又好。