豬流感(Swineinfluenza!SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性高度接觸傳染性的群發(fā)性呼吸道疾病!其特征為突發(fā)咳嗽#呼吸困難#發(fā)熱#衰竭及迅速康復(fù)!豬不分年齡#品種和性別均能感染!是規(guī)模化豬場普遍存在難以根治的群發(fā)性疾病之一$ 1病毒特性豬流感病毒屬于正粘病毒科(0rthomyxoviridae)!甲型流感病毒屬(Influenza virus A)!典型病毒粒子呈球狀!直徑為 80 nm~120nm$病毒存在于病豬或帶毒豬的鼻液或氣管%支氣管滲出液以及肺和肺淋巴結(jié)內(nèi)!在雞胚尿囊腔#羊膜腔中及 MDCK#Vero細胞系均能良好增殖&研究表明!豬流感在雞胚增殖的敏感性遠大于MDCK細胞!差異極顯著!故常用雞胚接種進行病毒分離&同時!MDCK與Vero細胞系比較!MDCK細胞的敏感性大于Vero細胞!病毒增殖也較快!這為流感病毒在哺乳動物細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗創(chuàng)造了條件[1!2&] 2豬流感的基因組結(jié)構(gòu)豬流感病毒屬單股負鏈RNA病毒!基因組約為13.6 kb! 由大小不等的8個獨立片段組成&8個基因片段編碼10個基因產(chǎn)物!其中片段1!3分別編碼PB2%PB1和PB3聚合酶!片段4和片段6分別編碼血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)!片段5 編碼核蛋白(NP)!片段7編碼病毒基質(zhì)蛋白Ml和離子通道蛋白M2!片段8編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSl!NS2&8個基因片段的3’末端和5’末端都有保守的核苷酸序列!5’末端13個核苷酸序列是3’-GGAACAAAGAUGAppp-5’!3’末端的12個核苷酸序列是3’-OH-UCGU(C)UUUCGUCC-5’!這些序列的內(nèi)部互補性對體內(nèi)體外的最佳轉(zhuǎn)錄是至關(guān)重要的&另外這些末端序列也是激活流感病毒多聚酶活性!切下宿主成熟mRNA帽子結(jié)構(gòu)形成病毒前體mRNA上所必需& 3豬流感基因編碼蛋白 HA蛋白是病毒主要的糖蛋白!也是流感病毒主要的表面抗原!能夠結(jié)合細胞表面受體!利于病毒穿膜!并能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生!產(chǎn)生免疫保護作用&HA分子量為75 Ku!約由562~566個氨基酸殘基組成&這些殘基包含信號肽%HAl和HA2部分!HAl和HA2兩部分之間由一個精氨酸連接&HA產(chǎn)生后到其發(fā)揮作用時!還經(jīng)過幾個切割加工過程!包括N端信號肽的切除及HAl和HA2的產(chǎn)生!這是病毒進入細胞體內(nèi)進行復(fù)制的前提&信號肽識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜!HA合成后信號肽就被切除!同時!HA也被切割成HAl和HA2&切割時去掉一個或多個氨基酸殘基!這與宿主細胞及毒株的毒力有關(guān)&HA單體由呈球狀的頭部和柄兩部分構(gòu)成!以三聚體的形式鑲嵌在雙層類脂膜上& NA是構(gòu)成病毒囊膜纖突的另一個重要蛋白成分!呈啞鈴狀!以四聚體形式存在&NA由453個氨基酸組成!作用是水解細胞表面的特異性糖蛋白末端的N"乙酰基神經(jīng)氨酸!避免病毒粒子的聚集!利于病毒釋放!對病毒在感染細胞周圍的擴散能力有很大影響&它的一級結(jié)構(gòu)包括氨基端胞漿尾%非極性跨膜區(qū)%莖部和頭部共4個結(jié)構(gòu)域&NA 酶活性的催化中心位于頭部頂端!呈凹陷狀!每個NA單體都有一個!所以NA纖突具有4個催化中心& 3.3核蛋白(NP)NP是一種單體磷酸化的多肽!是構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分&NP分子量約60 Ku!約有500個氨基酸! 具體特異性!是流感病毒診斷最具代表性的蛋白&倪建強等3[] 利用含組氨酸標簽的pET30原核表達系統(tǒng)!表達純化出NP 蛋白作為診斷抗原!其特異性高&NP至少有3個互相重疊的抗原區(qū)!其中一個區(qū)在各株流感病毒間均存在!針對這一區(qū)的單克隆抗體可抑制病毒RNA的轉(zhuǎn)錄&??????(Polymerase)由PB1% PB2和PB3組成!其分子量分別為96 Ku%87 Ku和85 Ku3個聚合酶與NP蛋白和病毒RNA相連接!構(gòu)成病毒特異性的聚合酶蛋白復(fù)合體!具有轉(zhuǎn)錄和核酸內(nèi)切酶的活性&它們的氨基酸序列上都含有一特異的親核序列區(qū)!以便使這3種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進入細胞核&PB1的功能是在病毒 mRNA合成開始后催化新合成的延伸反應(yīng)(PB2的功能是識別并切割宿主細胞的mRNA帽狀結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生用于病毒RNA 轉(zhuǎn)錄的引物"PB3在病毒RNA合成過程中的作用尚不清楚! 可能是一種蛋白激酶或解旋蛋白M1和M2屬于非糖基化蛋白! 富含精氨酸!分別由252個和97個氨基酸組成"M1是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白!具特異性!其抗原性的差異也是流感病毒分型依據(jù)之一"M2是一種跨膜蛋白!以四聚體形式存在于感染細胞的細胞膜上!起質(zhì)子通道作用!能使M1膜打開!病毒 RNP進入胞漿" (Nonstructural Protei ns!NS)!NSl與NS2相互間有70個氨基酸重疊!分別由不同的 mRNA翻譯"NSl在細胞核內(nèi)合成并積聚!NS2主要在胞漿中! 它們分別在早期感染和晚期感染存在"NS蛋白的N末端含一個典型的細胞核定位信號(NES)!被認為在病毒vRNP向細胞核外轉(zhuǎn)運的過程中發(fā)揮作用"Neumann等4[]!發(fā)現(xiàn)當細胞感染了缺少NS2蛋白的病毒或病毒NS2位點發(fā)生改變時!vRNP 復(fù)合體滯留在細胞核內(nèi)不能向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運" 4豬流感病毒的變異誘發(fā)豬流感病毒發(fā)生變異的主要機理有$%1&抗原漂移 (antigenic drift)$基因組自發(fā)的點突變引起小幅度的變異!積累到一定程度或正好使抗原決定簇發(fā)生改變"%2&抗原轉(zhuǎn)變 (genetic shift)$兩種不同亞型病毒感染同一宿主細胞!兩者的基因片段發(fā)生遺傳重組"%3&RNA重組(RNArecombination)"%4& 缺損性病毒顆粒的產(chǎn)生" 在單克隆抗體和自然免疫應(yīng)答的選擇壓力下!SlV各節(jié)段發(fā)生了不同程度的遺傳進化"1930年分離的第一株豬流感病毒HA基因漂移發(fā)生率估計在每年0.4%!0.48%[5]"M1#M2基因的變異率相對較慢!M2基因變異較M1快!將 A/Sw/Quebec/5393/91與A/Sw/Quebec/192/81流感株比較發(fā)現(xiàn)!M1蛋白的變異率約為0.08"!M2蛋白的變異率約為 0.51%6[]"豬流感病毒H1N1的NP基因以每年3.41個核苷酸發(fā)生改變!對應(yīng)的是每年0.34個氨基酸發(fā)生改變7[]" 豬上皮細胞表面同時存在唾液酸-a-2!6半乳糖苷 (SAa-2!6-Gal)和SAa-2!3-Gal受體位點!因此豬能夠同時感染人流感病毒和禽流感病毒"當2個或2個以上流感病毒同時感染一個豬體細胞時!在增殖過程中不同病毒的基因組片段可以隨機重新組合!產(chǎn)生新的流感病毒亞型8[]"Karasin等9[] 系統(tǒng)分析印地安那州H1N2亞型發(fā)現(xiàn)是由古典H1型和美國 1998年出現(xiàn)的H3N2基因重組的結(jié)果"Webby等[10]發(fā)現(xiàn)美國分離株H1N2是由H1N1的HA基因和H3N2的另外7個基因重組的結(jié)果"同時發(fā)現(xiàn)!不含HA基因的H1N2與H3N2的相似程度高于Karasin報道的H1N2!這也說明各個H1N2重組株有其獨立的重組過程"Marozin等1[1]比較歐洲的H1N1# H1N2和H3N2型SIV發(fā)現(xiàn)!各個基因型間發(fā)生了基因交換" 同時發(fā)現(xiàn)1999年法國分離豬源H3N2在抗原性上與 A/Sydney/5/19相關(guān)性很高!這揭示了豬與人的的病毒之間發(fā)生了抗原轉(zhuǎn)變" 國內(nèi)從山東豬分離出H9N2流感病毒!分析可能是由雞和鴨流感病毒重組的結(jié)果1[2]"繼H9N2亞型流感病毒1998年首次從豬群中分離到!李海燕等[13]部分序列分析發(fā)現(xiàn)豬源 H9N2亞型與國內(nèi)分離的禽流感病毒高度同源!從血清學和病毒學證明了H9N2亞型病毒在我國豬群中存在" 5豬流感病毒的疫苗研制當前!豬流感病毒疫苗的使用主要還是滅活疫苗!隨著分子生物學的發(fā)展!促進了基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的建立! 運用此類技術(shù)對疫苗進行了多方面的研究" 豬流感病毒活載體疫苗是將表面抗原HA和#或NA基因克隆到病毒活載體上!表達融合蛋白用于免疫"HA蛋白因其良好的免疫原性使其成為基因工程疫苗的首選!HA誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和中和抗體所提供的有效保護力大于NA"Tang等1[4]將豬H3N2型流感 HA基因克隆進腺病毒構(gòu)建重組體疫苗(rAd-HA)!接種小鼠后能夠部分保護人流感病毒A/HK/1/68(H3N2)的攻擊"Ronald等1[5] 構(gòu)建了表達豬H3N2型流感HA基因腺病毒重組體!將其接種三周齡仔豬!四周后!接種HA重組體的豬產(chǎn)生高水平的血凝抗體"在其它病毒載體的探索上!國內(nèi)成功地在桿狀病毒系統(tǒng)中表達了SIVA/Swine/HeNan/703/2001(H3N2)NA基因!Western $%&’和神經(jīng)氨酸酶活性檢測結(jié)果顯示!表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性和神經(jīng)氨酸酶活性1[6]"同時H3亞型豬流感病毒HA基因重組偽狂犬病毒載體也獲得成功[17]" 近年來!國外學者嘗試將M2蛋白(M2e)作為免疫原研制疫苗"2002年!heinen等1[8]構(gòu)建了表達M2e的DNA疫苗!產(chǎn)生的抗體不能中和病毒!感染H1N1后!不能對豬提供保護力! 同時促進豬出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀"這與heinen等1[92]001年提出的M2e產(chǎn)生抗體的增強作用利于機體保護的觀點不一致" 豬感染病毒后!細胞膜表面表達M2e!接合M2的抗體通過細胞尋靶促進感染細胞死亡!但由于產(chǎn)生抗體不具病毒中和能力!當病毒感染量太高!就不能對機體提供有效保護"事實表明!將M2蛋白作為免疫抗原還需要進一步探討" 與滅活疫苗相比!流感減毒活疫苗對流感能夠提供更持久的保護!同時!活疫苗能夠誘導(dǎo)局部和全身性的綜合性抗體以及CMI(細胞免疫)"近年來!反向遺傳學開始應(yīng)用于流感病毒的研制!反向遺傳操作技術(shù)是指通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆!在病毒cDNA分子水平上對其進行體外人工操作"該技術(shù)在人流感弱毒疫苗的開發(fā)獲得成功!1999年!Fodor等2[0]首次通過12質(zhì)粒系統(tǒng)拯救出流感病毒!其中8個含人源pol I啟動子和丁型肝炎病毒核酶序列調(diào)控的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(transcription plasmid)分別克隆出8條流感vRNA!另4個表達質(zhì)粒pGT表達出PBl!PB2!PA和NP 蛋白’2000年Hoffman等[21]在此基礎(chǔ)上進行改進!通過8個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染!成功地拯救出流感病毒!主要方法是構(gòu)建含有pol I-poi II雙啟動子的質(zhì)粒載體!在pol I啟動子與終止子間插入 pol II啟動子0和多聚腺苷酸!再將病毒基因插入該系統(tǒng)!利用細胞酶系統(tǒng)拯救出流感病毒’也有報道構(gòu)建出流感病毒弱毒苗!其中HA和NA基因來自H5N1!其余基因來自H1N1" 質(zhì)粒系統(tǒng)拯救流感病毒的成功!表明可以在拯救株上引入多個變異位點!減弱毒株活性!研制出安生性更好的弱毒疫苗" 迄今為止!國內(nèi)外均沒有成功拯救出SIV的報道!但該技術(shù)對人流感病毒的成功拯救!表明反向遺傳技術(shù)是豬流感弱毒疫苗研制的方向"但是!反向遺傳技術(shù)研制弱毒苗仍然存在基因突變的可能性!因而在通向制備弱毒苗的道路上仍有很多問題亟待解決! 研究人員嘗試將NP蛋白作為流感基因工程疫苗的添加成份來加強免疫"Ronald等1[5]構(gòu)建的表達NP蛋白的腺病毒重組體能減少SIV的復(fù)制"同時促進流感病毒的消除!heinen等[18]構(gòu)建表達M2#NP蛋白的疫苗能產(chǎn)生針對NP蛋白的淋巴組織增生"并且機體產(chǎn)生體液免疫的同時有細胞免疫!這可能由于NP蛋白上存在保守的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位和交叉保護抗原表位"能夠刺激機體產(chǎn)生非特異性的細胞免疫!Larsen等2[2]把含有白介素6 (interleuki n-6)作為佐劑的HA DNA疫苗免疫豬"發(fā)現(xiàn)能夠刺激體液免疫的產(chǎn)生"但不能顯著地增強豬的免疫反應(yīng)! Haneberg等2[3]在流感病毒滅活疫苗中混入霍亂毒素或一種細菌微粒可促進淋巴組織介導(dǎo)的免疫反應(yīng)"提高疫苗對機體的保護力!Hilgers等2[4]利用磺豬流感病毒分子生物學研究進展吳華!郭萬柱* (四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心!四川雅安625014) 中圖分類號"S852.65+9.5文獻標識碼"A文章編號"1008-0589(2006)02-0238-03 豬流感(Swine influenza!SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性高度接觸傳染性的群發(fā)性呼吸道疾病!其特征為突發(fā)咳嗽#呼吸困難#發(fā)熱#衰竭及迅速康復(fù)!豬不分年齡#品種和性別均能感染!是規(guī)模化豬場普遍存在難以根治的群發(fā)性疾病之一$ 1病毒特性豬流感病毒屬于正粘病毒科(0rthomyxoviridae)!甲型流感病毒屬(Influenza virus A)!典型病毒粒子呈球狀!直徑為 80 nm~120nm$病毒存在于病豬或帶毒豬的鼻液或氣管%支氣管滲出液以及肺和肺淋巴結(jié)內(nèi)!在雞胚尿囊腔#羊膜腔中及 MDCK#Vero細胞系均能良好增殖&研究表明!豬流感在雞胚增殖的敏感性遠大于MDCK細胞!差異極顯著!故常用雞胚接種進行病毒分離&同時!MDCK與Vero細胞系比較!MDCK細胞的敏感性大于Vero細胞!病毒增殖也較快!這為流感病毒在哺乳動物細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗創(chuàng)造了條件[1!2&] 2豬流感的基因組結(jié)構(gòu)豬流感病毒屬單股負鏈RNA病毒!基因組約為13.6 kb! 由大小不等的8個獨立片段組成&8個基因片段編碼10個基因產(chǎn)物!其中片段1!3分別編碼PB2%PB1和PB3聚合酶!片段4和片段6分別編碼血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)!片段5 編碼核蛋白(NP)!片段7編碼病毒基質(zhì)蛋白Ml和離子通道蛋白M2!片段8編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSl!NS2&8個基因片段的3’末端和5’末端都有保守的核苷酸序列!5’末端13個核苷酸序列是3’-GGAACAAAGAUGAppp-5’!3’末端的12個核苷酸序列是3’-OH-UCGU(C)UUUCGUCC-5’!這些序列的內(nèi)部互補性對體內(nèi)體外的最佳轉(zhuǎn)錄是至關(guān)重要的&另外這些末端序列也是激活流感病毒多聚酶活性!切下宿主成熟mRNA帽子結(jié)構(gòu)形成病毒前體mRNA上所必需& 3豬流感基因編碼蛋白 HA蛋白是病毒主要的糖蛋白!也是流感病毒主要的表面抗原!能夠結(jié)合細胞表面受體!利于病毒穿膜!并能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生!產(chǎn)生免疫保護作用&HA分子量為75 Ku!約由562~566個氨基酸殘基組成&這些殘基包含信號肽%HAl和HA2部分!HAl和HA2兩部分之間由一個精氨酸連接&HA產(chǎn)生后到其發(fā)揮作用時!還經(jīng)過幾個切割加工過程!包括N端信號肽的切除及HAl和HA2的產(chǎn)生!這是病毒進入細胞體內(nèi)進行復(fù)制的前提&信號肽識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜!HA合成后信號肽就被切除!同時!HA也被切割成HAl和HA2&切割時去掉一個或多個氨基酸殘基!這與宿主細胞及毒株的毒力有關(guān)&HA單體由呈球狀的頭部和柄兩部分構(gòu)成!以三聚體的形式鑲嵌在雙層類脂膜上& NA是構(gòu)成病毒囊膜纖突的另一個重要蛋白成分!呈啞鈴狀!以四聚體形式存在&NA由453個氨基酸組成!作用是水解細胞表面的特異性糖蛋白末端的N"乙酰基神經(jīng)氨酸!避免病毒粒子的聚集!利于病毒釋放!對病毒在感染細胞周圍的擴散能力有很大影響&它的一級結(jié)構(gòu)包括氨基端胞漿尾%非極性跨膜區(qū)%莖部和頭部共4個結(jié)構(gòu)域&NA 酶活性的催化中心位于頭部頂端!呈凹陷狀!每個NA單體都有一個!所以NA纖突具有4個催化中心& 3.3核蛋白(NP)NP是一種單體磷酸化的多肽!是構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分&NP分子量約60 Ku!約有500個氨基酸! 具體特異性!是流感病毒診斷最具代表性的蛋白&倪建強等3[] 利用含組氨酸標簽的pET30原核表達系統(tǒng)!表達純化出NP 蛋白作為診斷抗原!其特異性高&NP至少有3個互相重疊的抗原區(qū)!其中一個區(qū)在各株流感病毒間均存在!針對這一區(qū)的單克隆抗體可抑制病毒RNA的轉(zhuǎn)錄&??????(Polymerase)由PB1% PB2和PB3組成!其分子量分別為96 Ku%87 Ku和85 Ku3個聚合酶與NP蛋白和病毒RNA相連接!構(gòu)成病毒特異性的聚合酶蛋白復(fù)合體!具有轉(zhuǎn)錄和核酸內(nèi)切酶的活性&它們的氨基酸序列上都含有一特異的親核序列區(qū)!以便使這3種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進入細胞核&PB1的功能是在病毒 mRNA合成開始后催化新合成的延伸反應(yīng)(PB2的功能是識別并切割宿主細胞的mRNA帽狀結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生用于病毒RNA 轉(zhuǎn)錄的引物"PB3在病毒RNA合成過程中的作用尚不清楚! 可能是一種蛋白激酶或解旋蛋白M1和M2屬于非糖基化蛋白! 富含精氨酸!分別由252個和97個氨基酸組成"M1是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白!具特異性!其抗原性的差異也是流感病毒分型依據(jù)之一"M2是一種跨膜蛋白!以四聚體形式存在于感染細胞的細胞膜上!起質(zhì)子通道作用!能使M1膜打開!病毒 RNP進入胞漿"(Nonstructural Proteins!NS)!NSl與NS2相互間有70個氨基酸重疊!分別由不同的 mRNA翻譯"NSl在細胞核內(nèi)合成并積聚!NS2主要在胞漿中! 它們分別在早期感染和晚期感染存在"NS蛋白的N末端含一個典型的細胞核定位信號(NES)!被認為在病毒vRNP向細胞核外轉(zhuǎn)運的過程中發(fā)揮作用"Neumann等4[]!發(fā)現(xiàn)當細胞感染了缺少NS2蛋白的病毒或病毒NS2位點發(fā)生改變時!vRNP 復(fù)合體滯留在細胞核內(nèi)不能向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運" 4豬流感病毒的變異誘發(fā)豬流感病毒發(fā)生變異的主要機理有$%1&抗原漂移 (antigenic drift)$基因組自發(fā)的點突變引起小幅度的變異!積累到一定程度或正好使抗原決定簇發(fā)生改變"%2&抗原轉(zhuǎn)變 (genetic shift)$兩種不同亞型病毒感染同一宿主細胞!兩者的基因片段發(fā)生遺傳重組"%3&RNA重組(RNArecombination)"%4& 缺損性病毒顆粒的產(chǎn)生" 在單克隆抗體和自然免疫應(yīng)答的選擇壓力下!SlV各節(jié)段發(fā)生了不同程度的遺傳進化"1930年分離的第一株豬流感病毒HA基因漂移發(fā)生率估計在每年0.4%!0.48%[5]"M1#M2基因的變異率相對較慢!M2基因變異較M1快!將 A/Sw/Quebec/5393/91與A/Sw/Quebec/192/81流感株比較發(fā)現(xiàn)!M1蛋白的變異率約為0.08"!M2蛋白的變異率約為 0.51%6[]"豬流感病毒H1N1的NP基因以每年3.41個核苷酸發(fā)生改變!對應(yīng)的是每年0.34個氨基酸發(fā)生改變7[]" 豬上皮細胞表面同時存在唾液酸-a-2!6半乳糖苷 (SAa-2!6-Gal)和SAa-2!3-Gal受體位點!因此豬能夠同時感染人流感病毒和禽流感病毒"當2個或2個以上流感病毒同時感染一個豬體細胞時!在增殖過程中不同病毒的基因組片段可以隨機重新組合!產(chǎn)生新的流感病毒亞型8[]"Karasin等9[] 系統(tǒng)分析印地安那州H1N2亞型發(fā)現(xiàn)是由古典H1型和美國 1998年出現(xiàn)的H3N2基因重組的結(jié)果"Webby等[10]發(fā)現(xiàn)美國分離株H1N2是由H1N1的HA基因和H3N2的另外7個基因重組的結(jié)果"同時發(fā)現(xiàn)!不含HA基因的H1N2與H3N2的相似程度高于Karasin報道的H1N2!這也說明各個H1N2重組株有其獨立的重組過程"Marozin等1[1]比較歐洲的H1N1# H1N2和H3N2型SIV發(fā)現(xiàn)!各個基因型間發(fā)生了基因交換" 同時發(fā)現(xiàn)1999年法國分離豬源H3N2在抗原性上與 A/Sydney/5/19相關(guān)性很高!這揭示了豬與人的的病毒之間發(fā)生了抗原轉(zhuǎn)變" 國內(nèi)從山東豬分離出H9N2流感病毒!分析可能是由雞和鴨流感病毒重組的結(jié)果1[2]"繼H9N2亞型流感病毒1998年首次從豬群中分離到!李海燕等[13]部分序列分析發(fā)現(xiàn)豬源 H9N2亞型與國內(nèi)分離的禽流感病毒高度同源!從血清學和病毒學證明了H9N2亞型病毒在我國豬群中存在" 5豬流感病毒的疫苗研制當前!豬流感病毒疫苗的使用主要還是滅活疫苗!隨著分子生物學的發(fā)展!促進了基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的建立! 運用此類技術(shù)對疫苗進行了多方面的研究" 豬流感病毒活載體疫苗是將表面抗原HA和#或NA基因克隆到病毒活載體上!表達融合蛋白用于免疫"HA蛋白因其良好的免疫原性使其成為基因工程疫苗的首選!HA誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和中和抗體所提供的有效保護力大于NA"Tang等1[4]將豬H3N2型流感 HA基因克隆進腺病毒構(gòu)建重組體疫苗(rAd-HA)!接種小鼠后能夠部分保護人流感病毒A/HK/1/68(H3N2)的攻擊"Ronald等1[5] 構(gòu)建了表達豬H3N2型流感HA基因腺病毒重組體!將其接種三周齡仔豬!四周后!接種HA重組體的豬產(chǎn)生高水平的血凝抗體"在其它病毒載體的探索上!國內(nèi)成功地在桿狀病毒系統(tǒng)中表達了SIVA/Swine/HeNan/703/2001(H3N2)NA基因!Western $%&’和神經(jīng)氨酸酶活性檢測結(jié)果顯示!表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性和神經(jīng)氨酸酶活性1[6]"同時H3亞型豬流感病毒HA基因重組偽狂犬病毒載體也獲得成功[17]" 近年來!國外學者嘗試將M2蛋白(M2e)作為免疫原研制疫苗"2002年!heinen等1[8]構(gòu)建了表達M2e的DNA疫苗!產(chǎn)生的抗體不能中和病毒!感染H1N1后!不能對豬提供保護力! 同時促進豬出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀"這與heinen等1[92]001年提出的M2e產(chǎn)生抗體的增強作用利于機體保護的觀點不一致" 豬感染病毒后!細胞膜表面表達M2e!接合M2的抗體通過細胞尋靶促進感染細胞死亡!但由于產(chǎn)生抗體不具病毒中和能力!當病毒感染量太高!就不能對機體提供有效保護"事實表明!將M2蛋白作為免疫抗原還需要進一步探討" 與滅活疫苗相比!流感減毒活疫苗對流感能夠提供更持久的保護!同時!活疫苗能夠誘導(dǎo)局部和全身性的綜合性抗體以及CMI(細胞免疫)"近年來!反向遺傳學開始應(yīng)用于流感病毒的研制!反向遺傳操作技術(shù)是指通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆!在病毒cDNA分子水平上對其進行體外人工操作"該技術(shù)在人流感弱毒疫苗的開發(fā)獲得成功!1999年!Fodor等2[0]首次通過12質(zhì)粒系統(tǒng)拯救出流感病毒!其中8個含人源pol I啟動子和丁型肝炎病毒核酶序列調(diào)控的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(transcription plasmid)分別克隆出8條流感vRNA!另4個表達質(zhì)粒pGT表達出PBl!PB2!PA和NP 蛋白’2000年Hoffman等[21]在此基礎(chǔ)上進行改進!通過8個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染!成功地拯救出流感病毒!主要方法是構(gòu)建含有pol I-poi II雙啟動子的質(zhì)粒載體!在pol I啟動子與終止子間插入 pol II啟動子0和多聚腺苷酸!再將病毒基因插入該系統(tǒng)!利用細胞酶系統(tǒng)拯救出流感病毒’也有報道構(gòu)建出流感病毒弱毒苗!其中HA和NA基因來自H5N1!其余基因來自H1N1" 質(zhì)粒系統(tǒng)拯救流感病毒的成功!表明可以在拯救株上引入多個變異位點!減弱毒株活性!研制出安生性更好的弱毒疫苗" 迄今為止!國內(nèi)外均沒有成功拯救出SIV的報道!但該技術(shù)對人流感病毒的成功拯救!表明反向遺傳技術(shù)是豬流感弱毒疫苗研制的方向"但是!反向遺傳技術(shù)研制弱毒苗仍然存在基因突變的可能性!因而在通向制備弱毒苗的道路上仍有很多問題亟待解決! 研究人員嘗試將NP蛋白作為流感基因工程疫苗的添加成份來加強免疫"Ronald等1[5]構(gòu)建的表達NP蛋白的腺病毒重組體能減少SIV的復(fù)制"同時促進流感病毒的消除!heinen等[18]構(gòu)建表達M2#NP蛋白的疫苗能產(chǎn)生針對NP蛋白的淋巴組織增生"并且機體產(chǎn)生體液免疫的同時有細胞免疫!這可能由于NP蛋白上存在保守的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位和交叉保護抗原表位"能夠刺激機體產(chǎn)生非特異性的細胞免疫!Larsen等2[2]把含有白介素6 (interleuki n-6)作為佐劑的HA DNA疫苗免疫豬"發(fā)現(xiàn)能夠刺激體液免疫的產(chǎn)生"但不能顯著地增強豬的免疫反應(yīng)! Haneberg等2[3]在流感病毒滅活疫苗中混入霍亂毒素或一種細菌微粒可促進淋巴組織介導(dǎo)的免疫反應(yīng)"提高疫苗對機體的保護力!Hilgers等2[4]利用磺基脂多糖(SLP)構(gòu)成的SLP/S/W復(fù)合物作為佐劑和滅活流感疫苗共同免疫豬"能很好地刺激豬體產(chǎn)生體液免疫"其免疫效力強于單純的水包油乳劑! 6結(jié)語豬流感的暴發(fā)和流行"對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失"同時" 因豬流感能夠感染人"其公共衛(wèi)生意義重大!對豬流感分子生物學#變異和免疫機制的進一步研究"將為基因工程疫苗的研制及豬流感控制起到很好的作用! 參考文獻: 基脂多糖(SLP)構(gòu)成的SLP/S/W復(fù)合物作為佐劑和滅活流感疫苗共同免疫豬"能很好地刺激豬體產(chǎn)生體液免疫"其免疫效力強于單純的水包油乳劑! 6結(jié)語豬流感的暴發(fā)和流行"對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失"同時" 因豬流感能夠感染人"其公共衛(wèi)生意義重大!對豬流感分子生物學#變異和免疫機制的進一步研究"將為基因工程疫苗的研制及豬流感控制起到很好的作用!
