玉米是世界上三大作物之一,對于國民經濟和人們生活具有重要的意義。也是我國主要的糧食作物之一,玉米自交系間雜種優勢給人們帶來巨大的經濟效益,但是玉米育種中面臨著推廣品種單一化,育種材料遺傳基礎越來越狹窄,基因庫日益貧乏的缺點。至1994年,四大核心種質約占86.3%。“八五”期間,我國審定的玉米主要品種的種質來源是瑞得和蘭卡斯特各占25.6%,四平頭,旅大紅骨各占17.9%和10.7% 。四大種質占到79.9%。種質的單一化,必然導致嚴重的不良后果,使農業生產遭到嚴重的損失。1970年美國玉米小斑病T小種大流行,而使70%的玉米雜交種嚴重減產。有利重組體的數量受到遺傳資源狹窄的限制,將使育種工作進展緩慢,甚至停滯不前。種質缺乏成為玉米育種的瓶頸,種質的創新工作成為急待解決的問題。
近代生物技術的興起極大地提高了人們創造變異和利用變異的能力。為了更好地使生物技術應用于農業生產,就必需了解各種生物技術的優缺點和各種生物技術結合的途徑,以便更好地應用于玉米的種質創新和育種中去。
1.種質創新的技術類型
花藥培養 是應用于玉米育種較為有效的手段。可以比常規的育種方法縮短育種年限2-4年。因為單倍體植株不存在顯隱性的問題,一旦發生突變,即可以表達,有利于性狀的選擇。吳甲林(1983)、母秋華等(1980,1982)等先后培育出多個花培自交系,并用利用其組配了在生產上大面積推廣的優良的雜交種。雖然花藥培養具有有利的特點,但同小麥和水稻相比仍然沒有顯著的優勢。提高玉米花粉愈傷組織誘導率和綠苗分化率是提高玉米花培能力的重要因素。
孤雌生殖 利用孤雌生殖合成純系,是單倍體育種的另一途徑。應用孤雌生殖簡便易行,沒有花培苗越冬的問題。由于直接獲得二倍體的頻率較高,并且逾越了染色體加倍的障礙。玉米孤雌生殖的誘導可以經過雜交、溫度處理、射線處理、利用異源的細胞質、授粉前后的藥物處理以及未授粉子房的培養等的方式進行,也可以不經過授粉直接通過藥物處理獲得。如以MH和DMSO的組合、GA3、NAA-KT、N6培養基、6-BA等方法進行誘導。郭樂群等(1997)利用藥物誘導孤雌生殖技術獲得了玉米純系540,并且組配了優良的組合。
幼胚培養 玉米的幼胚被可以用于產生有植株再生能力的愈傷組織。MS培養基應用得最為廣泛,2,4-D是誘發愈傷組織產生的唯一的激素,除去2,4- D的培養基可以再生植株。由于愈傷組織在培養過程中可產生體細胞無性系變異,因此可作為一種創造玉米新種質的方法。張舉仁等(1991)利用這種方法篩選出了多個耐鹽、配合力較高的自交系。
外源DNA導入 外源DNA導入的可以利用整體植株的卵細胞受精卵或者早期的胚細胞轉化DNA,方法簡便。單胚珠或者多胚珠的單雙子葉植物均可以應用,育種時間短,易于穩定。可以任意選擇生產上的當家的品種進行外源DNA的導入,達到目的性狀的轉移。Dewet等利用外源DNA導入實現了玉米葉斑病抗性的轉移,Ohta(1986)等得到了胚乳基因的高頻率的轉移。
基因工程 玉米的基因工程研究發展迅速,已經產生了轉基因植株,轉化方法和目的基因都增多。美國國際作物遺傳公司將一種對于害蟲有殺傷力的細菌毒蛋白基因拼接到只生活在玉米植株體內的某些微生物,伴隨著玉米植株的 生長,微生物也隨之生長,抵御玉米穿孔蟲的侵襲,確保玉米在不施用大量昂貴的殺蟲劑情況下增產。但是目前對于一般的研究單位尚沒有達到實用的程度。
物理誘變 電離輻射主要包括γ射線、X射線、中子和β射線等。其中應用最多的是γ射線和X射線,由于其穿透力較強,可以激活原子的內層的電子,使其離子化可以與其他的原子或者分子相結合,造成原子結合方式的轉變。山東農業科學院原子能所利用G060射線處理玉米自交系獲得了具有株型理想、果穗較大、抗病性好等優良特點的自交系原武02,這是輻射育種取得的成功例子。
化學誘變 化學誘變效率大約是自發突變的100-1000倍。在玉米上運用的誘變劑主要是:甲基磺酸乙酯,N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG),疊氮化鈉(NaN3)、硫酸二乙酯(DES)和MNUA等。EMS是目前使用最廣和效果最好的化學誘變劑,其誘導的突變大多是點突變。化學誘變的材料主要是種子、花粉等。目前處理是用EMS等與輕質的石蠟油混合,制備成濃度為0.1-0.2%的處理液,在適當的時間,把被處理的花藥涂抹在花絲上即可。化學誘變可以用來進行自交系的性狀改良。化學誘變的特點是對于供體的損傷較少,誘變的頻率較低,但是有利的突變較多。也可以用來進行抗性突變種質的篩選,產生新的抗性基因類型。
另外,人們也進行了一些玉米上的原生質體、體細胞雜交等方面的研究,但是由于各種原因,目前在玉米種質創新方面還沒有得到實際的應用,在此不作討論。
2、種質創新技術的結合
在現代的育種實踐中,除了上述的各種手段的單獨使用以外,還可以將幾種技術結合起來使用將更有利于玉米的種質的創新。
離體培養結合化學誘變技術 植物組織器官(包括花藥等)在離體培養過程中本身的遺傳性會發生改變,可以應用于植物品種的改良,種質的創新,兩者的結合具有以下的優點:培養密度高,極大地提高選擇的頻率,減少土地占用和人力消耗;單細胞的培養突變幾乎可以立刻表現出來,其表現不受相臨細胞的干擾沒有嵌和體現象;利用適當的選擇劑,可以將突變細胞從混合細胞中有效地選擇出來。
花藥的誘變處理 γ,X射線輔照以后,剝取花藥接種于適當的培養基上,誘導愈傷組織,照射到誘導培養之前可以間隔2-3天,以利于花藥恢復正常生長提高其出愈能力。采用這種方法,能夠避免射線對于培養基的不良的反應,但是可能影響培養的效果。先將處于單核靠邊期的花藥接種到培養基上,再進行照射,可以在一定程度上提高花粉發育的整齊度。
愈傷組織的誘變處理 愈傷組織誘變可以明顯增加變異的程度以及離體突變選擇的應用,可以作為誘變處理的對象,與常規的材料的處理不同之處在于,愈傷組織是處于無菌的環境的條件下,可以直接照射生長于培養皿或者三角瓶中的愈傷組織,避免污染。化學誘變可以采取直接向愈傷組織添加或者滴加誘變劑的方法。愈傷組織包括各種組織培養方法得到的愈傷組織。例如:胚培養,幼胚培養,花藥培養,子房培養等等。
愈傷組織導入外源DNA 采取向愈傷組織滴加一定量的DNA溶液的方法,促使DNA的導入。因為任何具有活躍的代謝活動和持續分裂的地方都具有增加外源DNA導入頻率的作用。例如,在花粉管通道技術中,在形成受精卵而進行的持續胚的分化的過程中,在植物的分生組織活躍的生長點附近具有吸收外源DNA的可能性。而愈傷組織具有持續的分裂和增殖的活性,而且愈傷組織吸收外源DNA具有更加可取之處,因為愈傷組織的細胞間隔或者細胞壁比其活體的細胞甚至生長點的細胞具有更高的DNA轉化的頻率。
總之,現代生物技術同玉米育種的結合趨勢是利用物理化學或者生物的方法創造變異或者引入外源的基因,然后通過生物技術的方法固定轉移這種變異,實現優良突變基因的重組,再通過常規育種的方法實現雜種優勢。并且在實際的育種過程中,單純使用那一種育種技術都不能達到體育種的要求,需要將各種生物技術結合起來,才能取得較好的育種效果。
近代生物技術的興起極大地提高了人們創造變異和利用變異的能力。為了更好地使生物技術應用于農業生產,就必需了解各種生物技術的優缺點和各種生物技術結合的途徑,以便更好地應用于玉米的種質創新和育種中去。
1.種質創新的技術類型
花藥培養 是應用于玉米育種較為有效的手段。可以比常規的育種方法縮短育種年限2-4年。因為單倍體植株不存在顯隱性的問題,一旦發生突變,即可以表達,有利于性狀的選擇。吳甲林(1983)、母秋華等(1980,1982)等先后培育出多個花培自交系,并用利用其組配了在生產上大面積推廣的優良的雜交種。雖然花藥培養具有有利的特點,但同小麥和水稻相比仍然沒有顯著的優勢。提高玉米花粉愈傷組織誘導率和綠苗分化率是提高玉米花培能力的重要因素。
孤雌生殖 利用孤雌生殖合成純系,是單倍體育種的另一途徑。應用孤雌生殖簡便易行,沒有花培苗越冬的問題。由于直接獲得二倍體的頻率較高,并且逾越了染色體加倍的障礙。玉米孤雌生殖的誘導可以經過雜交、溫度處理、射線處理、利用異源的細胞質、授粉前后的藥物處理以及未授粉子房的培養等的方式進行,也可以不經過授粉直接通過藥物處理獲得。如以MH和DMSO的組合、GA3、NAA-KT、N6培養基、6-BA等方法進行誘導。郭樂群等(1997)利用藥物誘導孤雌生殖技術獲得了玉米純系540,并且組配了優良的組合。
幼胚培養 玉米的幼胚被可以用于產生有植株再生能力的愈傷組織。MS培養基應用得最為廣泛,2,4-D是誘發愈傷組織產生的唯一的激素,除去2,4- D的培養基可以再生植株。由于愈傷組織在培養過程中可產生體細胞無性系變異,因此可作為一種創造玉米新種質的方法。張舉仁等(1991)利用這種方法篩選出了多個耐鹽、配合力較高的自交系。
外源DNA導入 外源DNA導入的可以利用整體植株的卵細胞受精卵或者早期的胚細胞轉化DNA,方法簡便。單胚珠或者多胚珠的單雙子葉植物均可以應用,育種時間短,易于穩定。可以任意選擇生產上的當家的品種進行外源DNA的導入,達到目的性狀的轉移。Dewet等利用外源DNA導入實現了玉米葉斑病抗性的轉移,Ohta(1986)等得到了胚乳基因的高頻率的轉移。
基因工程 玉米的基因工程研究發展迅速,已經產生了轉基因植株,轉化方法和目的基因都增多。美國國際作物遺傳公司將一種對于害蟲有殺傷力的細菌毒蛋白基因拼接到只生活在玉米植株體內的某些微生物,伴隨著玉米植株的 生長,微生物也隨之生長,抵御玉米穿孔蟲的侵襲,確保玉米在不施用大量昂貴的殺蟲劑情況下增產。但是目前對于一般的研究單位尚沒有達到實用的程度。
物理誘變 電離輻射主要包括γ射線、X射線、中子和β射線等。其中應用最多的是γ射線和X射線,由于其穿透力較強,可以激活原子的內層的電子,使其離子化可以與其他的原子或者分子相結合,造成原子結合方式的轉變。山東農業科學院原子能所利用G060射線處理玉米自交系獲得了具有株型理想、果穗較大、抗病性好等優良特點的自交系原武02,這是輻射育種取得的成功例子。
化學誘變 化學誘變效率大約是自發突變的100-1000倍。在玉米上運用的誘變劑主要是:甲基磺酸乙酯,N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG),疊氮化鈉(NaN3)、硫酸二乙酯(DES)和MNUA等。EMS是目前使用最廣和效果最好的化學誘變劑,其誘導的突變大多是點突變。化學誘變的材料主要是種子、花粉等。目前處理是用EMS等與輕質的石蠟油混合,制備成濃度為0.1-0.2%的處理液,在適當的時間,把被處理的花藥涂抹在花絲上即可。化學誘變可以用來進行自交系的性狀改良。化學誘變的特點是對于供體的損傷較少,誘變的頻率較低,但是有利的突變較多。也可以用來進行抗性突變種質的篩選,產生新的抗性基因類型。
另外,人們也進行了一些玉米上的原生質體、體細胞雜交等方面的研究,但是由于各種原因,目前在玉米種質創新方面還沒有得到實際的應用,在此不作討論。
2、種質創新技術的結合
在現代的育種實踐中,除了上述的各種手段的單獨使用以外,還可以將幾種技術結合起來使用將更有利于玉米的種質的創新。
離體培養結合化學誘變技術 植物組織器官(包括花藥等)在離體培養過程中本身的遺傳性會發生改變,可以應用于植物品種的改良,種質的創新,兩者的結合具有以下的優點:培養密度高,極大地提高選擇的頻率,減少土地占用和人力消耗;單細胞的培養突變幾乎可以立刻表現出來,其表現不受相臨細胞的干擾沒有嵌和體現象;利用適當的選擇劑,可以將突變細胞從混合細胞中有效地選擇出來。
花藥的誘變處理 γ,X射線輔照以后,剝取花藥接種于適當的培養基上,誘導愈傷組織,照射到誘導培養之前可以間隔2-3天,以利于花藥恢復正常生長提高其出愈能力。采用這種方法,能夠避免射線對于培養基的不良的反應,但是可能影響培養的效果。先將處于單核靠邊期的花藥接種到培養基上,再進行照射,可以在一定程度上提高花粉發育的整齊度。
愈傷組織的誘變處理 愈傷組織誘變可以明顯增加變異的程度以及離體突變選擇的應用,可以作為誘變處理的對象,與常規的材料的處理不同之處在于,愈傷組織是處于無菌的環境的條件下,可以直接照射生長于培養皿或者三角瓶中的愈傷組織,避免污染。化學誘變可以采取直接向愈傷組織添加或者滴加誘變劑的方法。愈傷組織包括各種組織培養方法得到的愈傷組織。例如:胚培養,幼胚培養,花藥培養,子房培養等等。
愈傷組織導入外源DNA 采取向愈傷組織滴加一定量的DNA溶液的方法,促使DNA的導入。因為任何具有活躍的代謝活動和持續分裂的地方都具有增加外源DNA導入頻率的作用。例如,在花粉管通道技術中,在形成受精卵而進行的持續胚的分化的過程中,在植物的分生組織活躍的生長點附近具有吸收外源DNA的可能性。而愈傷組織具有持續的分裂和增殖的活性,而且愈傷組織吸收外源DNA具有更加可取之處,因為愈傷組織的細胞間隔或者細胞壁比其活體的細胞甚至生長點的細胞具有更高的DNA轉化的頻率。
總之,現代生物技術同玉米育種的結合趨勢是利用物理化學或者生物的方法創造變異或者引入外源的基因,然后通過生物技術的方法固定轉移這種變異,實現優良突變基因的重組,再通過常規育種的方法實現雜種優勢。并且在實際的育種過程中,單純使用那一種育種技術都不能達到體育種的要求,需要將各種生物技術結合起來,才能取得較好的育種效果。